2019年10月1日，5-羟甲（jiǎ）基化胞嘧啶（dìng）（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病（bìng）研究领域取得重要进展。2型（xíng）糖尿病（T2D）的血管并发症是导（dǎo）致2型（xíng）糖（táng）尿病致残致死（sǐ）的重要病因，一直缺乏一（yī）种无创便捷（jié）的（de）临（lín）床途（tú）径（jìng）实现（xiàn）血管并发（fā）症的发生发展监（jiān）测，达到早发现（xiàn）、早干预，以提高T2D病人（rén）的（de）整（zhěng）体（tǐ）生活质量（liàng），减少卫生经济（jì）负担。

该（gāi）研究入组了62例2型糖尿病病人，采用（yòng）5hmC-Seal技术（shù）对血浆cfDNA中表（biǎo）观遗传标（biāo）志物5hmC的分布情况进（jìn）行（háng）检测，分析5hmC标志物与（yǔ）2型糖尿病血管（guǎn）并发症发（fā）生（shēng）发展的相关性。结果表明5hmC标志物的（de）变化与T2D合并（bìng）大血（xuè）管（guǎn）/微血（xuè）管事件（jiàn）具有相关性，主要涉及一些与血管生物（wù）学和糖尿病（包括胰岛（dǎo）素耐受和炎症反应）相关的（de）基因（yīn）和信号通路（lù）。该研究建立的16个（gè）基因-5hmC标志物组合检测可以准确区分有（yǒu）并发症和无并发症（zhèng）的2型糖尿病（bìng）病人[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显（xiǎn）优于传统临床变量（liàng）例（lì）如（rú）白蛋白尿。除此之外，还建立了13个基因-5hmC标（biāo）志物组合检测，可以进一步（bù）区分T2D合并单一（yī）并发症和多种并发（fā）症[实验组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优（yōu）于（yú）其他传统临床变量（liàng）。该研究得（dé）出结论，5hmC标志物反映了T2D病人大血管/微（wēi）血（xuè）管并发症发生过程（chéng）中（zhōng）的表观遗传（chuán）变化（huà），因而5hmC-Seal检测技术（shù）在（zài）监（jiān）测糖尿病血管（guǎn）并发（fā）症发生和进展方面具有良好（hǎo）的（de）临床应用前景。

本研究共纳入62例2型糖尿（niào）病病人，包括没（méi）有血管并发（fā）症的病（bìng）人（rén）12例，有（yǒu）单一血管并发症的（de）病人34例（24例发生大血（xuè）管事件（jiàn），10例发（fā）生微血管事件），以及有多种（zhǒng）血管并发（fā）症的（de）病人16例。试（shì）验收集62例病人血浆，提（tí）取cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行二（èr）代测序，通过生物信息学分析找（zhǎo）出并发症组（zǔ）与无（wú）并发症组之间有显（xiǎn）著5hmC修饰（shì）差异（yì）的（de）基（jī）因（yīn），单一并发症（zhèng）组（zǔ）和多种并发症组之间有显（xiǎn）著5hmC修饰差异的基因。随（suí）后利用回归模型对差异基因进一步筛（shāi）选、优化，弹性网络进（jìn）一步筛选，计算（suàn）加权平均（jun1）分，最后得到（dào）一组具有高（gāo）度灵敏度和（hé）特异性的（de）5hmC生物（wù）标（biāo）记物，并进一（yī）步在实（shí）验组中（zhōng）验证，分析其灵（líng）敏度（dù）和特异（yì）性。并将新（xīn）建立的（de）5hmC标（biāo）志（zhì）物基因组合的检测性能与传统临床变（biàn）量进行对（duì）比分析。最后对相关基因进（jìn）行了信号通路分析和功能探究（jiū）。

5hmC修饰水平与血管（guǎn）并发症具有相关性

利用（yòng）逻辑回归模型对62例有并发症和无并发症2型糖尿病病人（rén）的5hmC差异水平进行分析发现（xiàn），有（yǒu）并发症2型糖尿病病（bìng）人的622个差（chà）异修饰候选基因（包（bāo）括上调和（hé）下（xià）调（diào）基（jī）因）的归一化平均数（shù）要明（míng）显高（gāo）于无并发症的病人（P<0.001），但是（shì）单一并发症（zhèng）和多发并发症病人之间（jiān）没有显著差异。

之后将有（yǒu）单（dān）一并发症或多种并发症的50例病人用逻辑回归模型进行了对比（bǐ），发现多种（zhǒng）并发症（zhèng）的（de）病人的（de）153个差异修饰候（hòu）选基因（包（bāo）括上调和下（xià）调基因）的归一化平均数要低于无并发症病人（rén）（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无（wú）并发症患者（zhě）

62例2型糖尿病病人被随机分成（chéng）训（xùn）练组（n=31）和（hé）测（cè）试组（n=31）。利用弹（dàn）性网络筛选（xuǎn）后发现，16基因-5hmC标志物组合检测（cè）可（kě）以用于区分有并发症和无并（bìng）发症的2型糖尿病病人。

基（jī）于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的（de）加（jiā）权平均分分析，发现无并发症病人的分数（shù）在训练集和测试集中都明显低于有并发症的病人（rén）。只考虑加权平均（jun1）分的话，受试者工作特征曲线（xiàn）（ROC）分析表明将cutoff值（zhí）设（shè）置成0.5时，在测试组中（zhōng）中的灵敏度为60%，特异（yì）性（xìng）为100%。

5hmC标志（zhì）物可区分病人是单一并（bìng）发症（zhèng）还是多种并发症

50例有并（bìng）发症的2型糖（táng）尿病病人被随机分成训练组（n=25）和测（cè）试组（n=25）。利用弹性（xìng）网络筛（shāi）选（xuǎn）后发现，13基因-5hmC标（biāo）志物组（zǔ）合可以区（qū）分2型糖（táng）尿病病人是（shì）否（fǒu）发生单（dān）一并发症或多种（zhǒng）并（bìng）发（fā）症。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单一并发症和多（duō）种并（bìng）发症的加权平（píng）均（jun1）分（fèn），发现在训练集和（hé）测（cè）试（shì）集（jí）中单一（yī）并（bìng）发症和多种并发（fā）症（zhèng）病人的分数都有明显差异。值得一提的是，有肾病并发症和无肾病并发（fā）症（zhèng）病人的分数也有明（míng）显差异。利用加权（quán）平均分（fèn）作（zuò）为判断标准的受试者工作特征曲（qǔ）线（ROC）表明，在测试组中（zhōng）当将cutoff值设成0.69时，灵敏度（dù）为87.5%，特异（yì）性为68.8%。

5hmC标（biāo）志物与传统临（lín）床变（biàn）量/危险因子的对比

我（wǒ）们（men）评估了不同临床变量/危险（xiǎn）因（yīn）子（zǐ）用（yòng）于监测血管并（bìng）发症的灵敏（mǐn）度和特异性（见表1）。

信号（hào）通路分析和功能探究

有并（bìng）发（fā）症（zhèng）和无（wú）并（bìng）发症病人的135个差异候选基（jī）因的功能注释分析表明，这些基因（yīn）主要富集在一些经典的信号通路。错误发现率（lǜ）相关P值位于前10%和基因数目≥3的信（xìn）号通路（lù）包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信（xìn）号通路。由IGF1R和IL-10介导（dǎo）的信号通路（lù）与胰岛（dǎo）素（sù）抵抗及炎症反（fǎn）应（yīng）相关，在血管（guǎn）生物（wù）学和糖尿（niào）病（bìng）发生发展过程中发挥重（chóng）要作用。

Reactome相互作用网络的（de）中心（xīn）表明（míng），泛素编码（mǎ）基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素（sù）A-52亚基（jī）核糖（táng）体（tǐ）蛋白融（róng）合产物（wù）1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重（chóng）要连接者。在（zài）这135个差（chà）异候选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出（chū）与糖尿病病（bìng）程相关（guān）的倾向，表明（míng）5hmC和糖尿病血管并发症之间可（kě）能存在时间依赖性的相互作用。基于纵向时（shí）间队列（liè）的大样本研（yán）究，将可进一步明确5hmC变化和糖尿（niào）病持（chí）续时间之（zhī）间的动态（tài）关联。关（guān）于单（dān）一并发症和多种并发症病人（rén）的159个候选（xuǎn）标志基因的功能注释研究发现，存在细胞（bāo）-细胞连（lián）接、胶原（yuán）蛋白形（xíng）成（chéng）、新陈代谢、细胞应激（jī）应答信号通路的富集（jí），这些信号通路（lù）均（jun1）与细胞（bāo）基本功能（néng）密切相关。

血管并发症是三（sān）分之二糖尿（niào）病病人的死亡原因，若能及早有（yǒu）效控（kòng）制（zhì）血管并（bìng）发症的（de）发生，将极（jí）大地改善糖尿病病人的生存质量。该研（yán）究建（jiàn）立了一种利用cfDNA进行2型糖尿（niào）病（bìng）血管并（bìng）发症（zhèng）监（jiān）测的无创便捷方法，较目前临（lín）床标志物（wù）能更准确地监控血（xuè）管并发症的发生，从而提示（shì）临（lín）床及早（zǎo）采取应对措施，有（yǒu）效（xiào）控制病情进展。