2019年10月1日（rì），5-羟（qiǎng）甲基化（huà）胞（bāo）嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖（táng）尿病研究（jiū）领（lǐng）域取得重要进展。2型糖尿（niào）病（T2D）的血管并发症是导致2型糖尿病致残致死的重要（yào）病（bìng）因，一直缺乏一（yī）种无创便捷的临（lín）床途径实现（xiàn）血管并发（fā）症（zhèng）的发生发展监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病人（rén）的整体生活质量，减少卫生经济负担（dān）。

该研究入组了62例2型糖尿病病人，采用（yòng）5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观遗（yí）传标志物（wù）5hmC的分布情况（kuàng）进行检测（cè），分析5hmC标志物与2型糖尿病血管并（bìng）发症发生发展的相关性。结果（guǒ）表明（míng）5hmC标（biāo）志物的变（biàn）化与T2D合并大血管/微血管事件具有相关性，主要（yào）涉及一（yī）些与血（xuè）管生物学和（hé）糖尿病（bìng）（包括胰（yí）岛素耐受和炎（yán）症反应）相关的基因和信号通路。该研究建立的16个基因-5hmC标志物组合检测可以准（zhǔn）确区分有并（bìng）发症和无并发症的（de）2型糖尿病病人（rén）[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床变（biàn）量例如白蛋白尿。除此之外，还建（jiàn）立了13个基因-5hmC标志物组合检测，可以进一（yī）步区分T2D合（hé）并单一（yī）并发症和多种并发（fā）症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明（míng）显优于其他传统临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反（fǎn）映了T2D病人大血管/微（wēi）血管并发症发生过程中的表观遗传变化，因而（ér）5hmC-Seal检测技术在监（jiān）测糖尿病血管并发症（zhèng）发生（shēng）和进（jìn）展（zhǎn）方面具有良好的临（lín）床应用前景（jǐng）。

本研究共纳（nà）入62例2型糖尿病（bìng）病（bìng）人，包括没有血（xuè）管并发症的病人12例（lì），有（yǒu）单一血管并发（fā）症（zhèng）的病（bìng）人（rén）34例（24例发生大血（xuè）管（guǎn）事件，10例发生（shēng）微血管事件（jiàn）），以及有多种血管（guǎn）并发症（zhèng）的（de）病人（rén）16例。试验收集62例病（bìng）人（rén）血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行（háng）二代测序，通过生物信（xìn）息学分析找出（chū）并（bìng）发症组与（yǔ）无并发症（zhèng）组之间有（yǒu）显著（zhe）5hmC修饰差异的基因（yīn），单一并发症组和多种（zhǒng）并发症组之间有（yǒu）显著5hmC修饰（shì）差异（yì）的（de）基因。随后利用（yòng）回（huí）归模型对差异（yì）基因进一步筛选、优化，弹（dàn）性网络进一步筛选（xuǎn），计算加权平均分，最（zuì）后得到一（yī）组具有高度（dù）灵敏度和（hé）特异性的5hmC生（shēng）物标记物，并（bìng）进一步在实验组中（zhōng）验证，分（fèn）析其灵敏度和特异性。并将新建立的5hmC标志物基因组合的（de）检测性能与传（chuán）统（tǒng）临（lín）床变量进行对比分析。最后（hòu）对相关（guān）基（jī）因进行了（le）信号通路分析和（hé）功能（néng）探（tàn）究。

5hmC修饰水（shuǐ）平与血管并发（fā）症（zhèng）具有（yǒu）相关（guān）性

利用（yòng）逻辑回归模型对62例有（yǒu）并发症和无并发症2型糖尿病病人的5hmC差异水平进行分析发现，有并发（fā）症2型糖尿病病人（rén）的622个差异修饰候选基因（包（bāo）括上调和下调基因）的归一化平均数要明（míng）显高于（yú）无并发症的病人（P<0.001），但是单（dān）一（yī）并（bìng）发（fā）症（zhèng）和多发并发症（zhèng）病人之间没有（yǒu）显（xiǎn）著差异（yì）。

之后将有单（dān）一并发症或多种并发症（zhèng）的（de）50例（lì）病人用（yòng）逻辑（jí）回归模型进（jìn）行了对比，发（fā）现多种并发症的病人的（de）153个差异修饰候选基因（yīn）（包括上调和下调基因）的（de）归一化平均数要低于无并发（fā）症病（bìng）人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有（yǒu）无并发症患（huàn）者

62例（lì）2型（xíng）糖尿病病人被随机分成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利用弹性网（wǎng）络筛（shāi）选（xuǎn）后发现（xiàn），16基因-5hmC标（biāo）志（zhì）物组合（hé）检测（cè）可以用于（yú）区分有并发症和无并发症（zhèng）的2型糖尿病病人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分（fèn）析，发现无并发症病人的分数在训练集和测试（shì）集中都明显低于有并发症的病人。只（zhī）考虑加（jiā）权平均分（fèn）的话，受试者工作特征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置成0.5时，在（zài）测试组中中的灵（líng）敏度为60%，特异性（xìng）为100%。

5hmC标志物可（kě）区分（fèn）病人是单一并发（fā）症还是多种并发症（zhèng）

50例有并发症（zhèng）的2型糖尿病病人被随机（jī）分成训（xùn）练组（n=25）和测试组（n=25）。利（lì）用弹性网（wǎng）络筛选后发现（xiàn），13基因-5hmC标志物组（zǔ）合可以区分（fèn）2型糖尿病病人是（shì）否发生单一并发症或多种并发症。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们（men）计（jì）算了单一并发症（zhèng）和多种（zhǒng）并发症的（de）加权平均分，发现在训练集和测试集（jí）中单一并发症和（hé）多种并发症病人的分数都有明（míng）显差异。值（zhí）得一提的是（shì），有肾（shèn）病（bìng）并发（fā）症和无肾病并发（fā）症病（bìng）人的分数也有明显差异。利（lì）用（yòng）加权平（píng）均分作（zuò）为判断（duàn）标（biāo）准的受试（shì）者工作特征曲线（ROC）表（biǎo）明（míng），在测试组中当将cutoff值设成0.69时（shí），灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与传统临床变量（liàng）/危险因子的对（duì）比（bǐ）

我们评估（gū）了不同临（lín）床变量/危险因子用于（yú）监测血管并发症（zhèng）的（de）灵敏（mǐn）度和特异性（见表1）。

信号通（tōng）路分析（xī）和功能探究

有并发症和无并发症（zhèng）病人的135个（gè）差异候选（xuǎn）基因（yīn）的功（gōng）能注释分析表明，这些基因主要富集在一（yī）些经典的信（xìn）号通（tōng）路。错误发（fā）现率相关P值位于前10%和基因数目≥3的信（xìn）号通路包括由（yóu）IGF1R, IL-10和FGFR2所介导（dǎo）的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的（de）信号通路与胰岛素抵抗及（jí）炎症（zhèng）反应相关（guān），在血管生物学和糖尿病发生发展过程中发挥重（chóng）要作用（yòng）。

Reactome相互作用网络（luò）的中心表（biǎo）明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛（fàn）素C (UBC)，泛素A-52亚基核糖体（tǐ）蛋白融合产物1(UBA52)]是候选基因（yīn）（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重（chóng）要连接者。在（zài）这（zhè）135个（gè）差异候选基因中, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关的倾向，表明（míng）5hmC和糖尿病血（xuè）管并发症（zhèng）之间可能（néng）存在时间依（yī）赖（lài）性的相互作用。基（jī）于纵向时间队（duì）列的大样本研究，将可（kě）进一（yī）步明确5hmC变化和糖尿病持续时间之间的（de）动态关联。关（guān）于单一并发症和（hé）多种并发症（zhèng）病（bìng）人的159个候选标志基因的（de）功能注（zhù）释研究发现，存在（zài）细胞-细胞连接、胶原蛋白形成、新陈代谢、细（xì）胞（bāo）应（yīng）激应（yīng）答信号通路的富集，这些信号通路均与细（xì）胞（bāo）基本功能（néng）密切相关。

血管并发症是三分之（zhī）二糖（táng）尿病病人的死亡原因（yīn），若能及早有（yǒu）效控制（zhì）血管并发症的发生，将（jiāng）极大地改善糖尿病病人的生存质（zhì）量。该研究（jiū）建立了一种利用cfDNA进行2型糖尿病（bìng）血管并（bìng）发症监测的（de）无创便捷方（fāng）法，较目前临床标志物（wù）能更准（zhǔn）确地监控（kòng）血管并发（fā）症（zhèng）的发生，从而提示临（lín）床及早采取应对措施（shī），有效控（kòng）制病情进（jìn）展（zhǎn）。